01. January 2024

篩選小型模式生物的最佳利器 : COPAS VISION 大顆粒明視野影像流式細胞分選平台

編輯 / 中研院綜合型流式細胞儀實驗室

COPAS VISION 平台概述

流式細胞技術 (Flow Cytometry) 能夠根據細胞大小、顆粒性和螢光強度對複雜細胞群進行分析，是當代識別細胞群的主要技術之一。傳統流式細胞儀已廣泛用於分析單細胞，分選儀更可用於分選單細胞，但僅限於粒徑範圍 < 50 um 的顆粒。歷年來，欲分選較大物體的研究人員多限於使用顯微鏡進行手動操作，這項技術既耗時、繁瑣、容易出錯，並且嚴重限制了產量，顯示需要針對較大物體的高通量分選技術。自 1998 年以來，Union Biometrica 開發了一系列 COPAS 平台來分選大小介於 10～1500μm 的顆粒，系統在較低壓力下運行，並使用專有的溫和氣流轉向器進行分選，突破了傳統流式細胞儀的分選限制。近年推出的 COPAS VISION 細胞分選平台，更升級配備 CMOS 相機與 FlowPilot™ 影像分析軟體，為大顆粒分選儀增添即時明視野影像擷取功能，可以對活的多細胞生物體和其他對於傳統流式細胞儀而言太大的樣品類型，例如研究人員常仰賴的「模式生物」，包括秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）、黑腹果蠅蟲卵（Drosophila melanogaster eggs）、阿拉伯芥種子（Arabidopsis thaliana seeds）等，進行自動化高通量分析和分選，以及捕捉樣本中物件影像的能力。此外，COPAS VISION 分選儀還可直接分選脆弱的樣品，例如細胞團塊、脆弱的神經細胞或脂肪細胞等，讓研究人員可以進行完整的多細胞結構研究，探究組織、腫瘤、類器官 (Organoids) 或活的多細胞生物體中的細胞間相互作用，而無需破壞細胞簇 (Cell Cluster)。綜觀而言，COPAS VISION 將可為多細胞與小型模式生物等研究領域提供快速、靈敏、溫和的自動化篩選。

圖1. 具有明視野成像和分選功能的大顆粒流式細胞儀 - COPAS VISION 平台。

中研院綜合型流式細胞儀實驗室 COPAS VISION 1000 平台，搭載 488nm & 561nm 雷射，可同時偵測 4 組螢光，為目前全國唯一具有即時明視野影像擷取的大顆粒流式細胞分選儀，專門針對直徑 50 - 750 µm 物體進行快速分析與分選。

圖2. 綜合型流式細胞儀實驗室 COPAS VISION 1000 雷射配置。

特色1: 成像流式細胞技術 Imaging in Flow

成像流式細胞技術結合了流式細胞儀的高效能特性與顯微鏡的影像辨識兩者優點，自所得影像中測量大量特徵以提供豐富數據資料庫，讓研究人員可以更準確地確定每種顆粒類型的數量、測量形態特徵、驗證顆粒身份，從而衍生出新穎廣泛的科學應用。COPAS VISION 平台收集的數據與流式細胞儀一樣，由直方圖和各種點圖組成，研究人員可以在這些點圖上選取特定區域進行分析和分選。除此之外，來自選定地區的影像則為研究人員提供即時的物件辨識，進而確認樣品顆粒的身份。例如，小型底棲動物樣本中包含各種小型無脊椎動物，儘管大小相似，彼此卻截然不同，這可以透過收集的明視野影像輕鬆辨別。另一種有利於影像收集的樣本類型為由細胞簇發育成的類器官和類類器官組織，由於它們可以呈現各種形狀和大小，僅透過傳統流式細胞儀很難將其區分。

圖3. COPAS VISION 影像分析軟體 FlowPilot™ 操作介面。當物體被軸向地一個接著一個穿過雷射光束焦點時，COPAS 系統能夠透過消光、散射和螢光檢測器快速分析物體，然後記錄產生的訊號。物體的相對大小由消光探測器測量，該探測器記錄被阻擋光之訊號的時間長度；此參數對應於飛行時間（Time of Flight; TOF）。物體的光密度由被阻擋光的總積分訊號決定；此參數是物體的消光（Extinction; EXT）。其他檢測器測得的參數還包括前向散射 (Forward Scatter; FS)、側向散射 (Side Scatter; SS) 和螢光強度 (Fluorescence Intensity; FLU) 。所有光學訊號被轉換為電子訊號記錄下來，再藉由 FlowPilot™ 軟體加以分析。TOF 與物體的軸向長度有關，EXT 與物體的不透明或透明程度有關，FLU 與存在的螢光標籤或標記抗體的螢光量有關。FlowPilot™ 軟體的影像擷取功能進一步確定圈選區域的物件身分，一旦樣品穿過流動池 (flow cell) 時既捕獲其明視野影像，每秒最多可捕獲 300 張，解析度為 2.0 µm。

圖4. COPAS VISION 平台提供影像擷取功能，揭示了分析樣本中不同顆粒的身份。

特色2 : 專利技術核心 - 溫和氣動分選機制

COPAS VISION 平台配置承襲流式細胞儀的基本設計原理，但在幾個重要的設計領域與傳統流式細胞儀不同：

(1) COPAS VISION 1000 儀器的大口徑流通池可以容納 30 -750µm 的物體，該範圍比傳統流式細胞儀大得多。

(2) COPAS VISION 系統在較慢的流速和較低的壓力下運行，從而避免了標準流式細胞儀固有的潛在破壞性高剪切力。

(3) COPAS 技術的核心 - 專利氣動分選設置，利用空氣分流器將生物和大細胞分配到液滴中，無須施加大量靜電荷。

圖5. COPAS VISION 分選原理。樣品從連續攪拌的樣品杯輸送到流動池 (flow cell)，緊接著被鞘液包圍，鞘液透過流體動力學將樣品聚焦到流道的中心，以便由多個雷射進行審訊。監測流動池的是一個 CMOS 相機和一組雷射器，它們記錄穿過物體的影像並收集有關該物體的一系列參數（消光、飛行時間、螢光、散射等）。預設情況下，除非產生“分選”訊號，否則離開流道的所有流體都會被氣流轉移到“廢物/回收容器”。在這種情況下，空氣轉向器被短暫關閉，以產生包含可分選物體的液滴，然後該液滴直接落在出口噴嘴下方。總體而言，COPAS VISION 分選系統的設計特點允許對大型物體進行高速分析和溫和分選。這種溫和處理可保持生物體活性，同時提供純化生物材料的高回收率。

圖6. 類器官分選的細胞計數和成像數據。

研究人員可以選擇對樣品中的所有顆粒進行分選，或僅對那些符合特定分選標準的顆粒進行分選。左圖顯示依據大小和光密度排序的四個類器官群，以及不同圈選區域和相應分選結果。先利用 TOF 與 EXT 雙點圖定義 R2、R3、R4 和 R5 區域，再進一步分選符合一項標準的顆粒。首先將單細胞簇從 R2 區域分選到多孔盤中，接著從其他三個區域依序分選。右區圖像顯示每個細胞簇的光學和影像資訊。分析器Profiler 資料顯示每個不同細胞簇螢光表現強度，而明視野影像顯示每個不同細胞簇的形態特徵。

圖7. 樣品輸入與輸出。

上樣區配有懸浮攪拌器，樣品基本使用 Falcon 50 mL 錐形管（最大工作體積: 40mL），較大體積樣品可選 750 mL 攪拌樣品杯。X-Y 平台允許樣品分選到試管 (微量離心管、15mL、50mL) 、培養皿或多孔盤 (24、48、96 或 384 孔) 中。借助 COPAS VISION，單顆粒分選不再局限於標準多孔容器，使用者可以建立自訂輸出容器範本，每個分選位置可以設定不同的分選條件組合 (包括分選區域和分選數量）。分選全程在封閉的流動池中進行。

影像分析軟體 FlowPilot™

Union Biometrica 的 FlowPilot™軟體專為 COPAS VISION 儀器所開發。COPAS VISION 收集的數據以標準流式細胞儀格式存儲，可以使用其他流式細胞儀軟體進行分析; COPAS VISION 收集的影像則使用 FlowPilot™ 影像處理軟體進行分析。FlowPilot 軟體有兩個獨特的影像分析功能 - Profiler 與 Partial Profiling。

分析器功能 > Profiler 透過同時記錄沿著每個物體長度的消光、前向散射和螢光強度，將資料收集提升到一個新的層級。當物體通過流通池時，分析器將光訊號等級數位化分成連續的點測量，含有小亮螢光點的物體會產生螢光訊號以及對應的窄峰數據圖，均勻的螢光則產生相對穩定的高原型數據圖。Union Biometrica 儀器獨有的輪廓分析功能能夠以高達 10 MHz 的速率對物體進行數位化，從而能夠偵測物體內部微米級的特徵。該軟體以圖形方式將這些光學參數顯示為一系列波峰和波谷，直接追蹤物體穿過流通池時檢測到的物體內部訊號強度。每個物體的最終輪廓以圖形方式顯示所收集的所有光學參數的位置和強度。執行 Images Processing 功能時， Profiler 先確定所收集影像的興趣區域（ROI），進一步取得影像的寬度、高度、面積、周長、軸向長度、粗糙度和平均灰度的測量值。數據可以透過多種不同的方式查看和顯示，也可以儲存從影像分析導出的資料。

圖8. Profiler 分析器功能執行單一細胞簇影像擷取與分析。 COPAS VISION 收集到的影像進一步使用 FlowPilot™ 影像處理軟體進行分析。首先，確定影像的興趣區域（ROI），接著執行 Image Processing，獲得物體的寬度、高度、面積、週長、軸向長度、粗糙度和平均灰度測量值。

部分分析功能 > Partial Profiling 部分輪廓分析透過專注於輪廓的部分區域，允許使用者策略性地僅從該區域識別光學或螢光特徵，例如可以專門分析測量生物體頭部、尾部、中部或末端區域的消光和螢光。透過激活部分分析，輪廓特徵（峰值高度、寬度或計數）以及有限部分的積分值可以作為自己的定制參數進行分析和繪製。執行分選時能以物體內部的消光、散射或螢光變化為特徵，選擇和分選具有特定局部形態的對象。